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四川大学华西医院皮肤性病科冉玉平教授团队:伊曲康唑通过下调PDGF-D/PI3K/AKT/mTOR信号通路活性诱导婴儿血管瘤消退

四川大学华西医院皮肤性病科冉玉平教授团队于2019年7月在Journal of Investigative Dermatology(影响因子:6.290)发表文章“Itraconazole induces regression of infantile hemangioma via downregulation of the platelet-derived growth factor–D/PI3K/Akt/mTOR pathway”(长按下方二维码即可阅读全文)。




婴幼儿血管瘤(infantile hemangiomas,IHs)的发病率在婴幼儿中占8%~10%,在早产儿或低体重新生儿中甚至高达22%,是婴幼儿最常见的皮肤良性肿瘤。血管瘤通常在1岁以内快速增殖,随后逐渐进入自行消退期,持续时间长达5~9年。10%~20%患儿瘤体随年龄增长而增大,甚至出现如溃疡、出血、感染等严重并发症。由于IHs分类繁多,个体差异大,治疗IHs对临床医生是一种挑战。目前血管瘤口服用药的标准治疗包括糖皮质激素和普萘诺尔,然而仍有很多血管瘤患儿的临床疗效不令人满意。


伊曲康唑已上市20多年,广泛用于治疗婴幼儿真菌病,尤其常用于婴幼儿深部真菌病的预防和治疗,其有效性和安全性已得到广泛认可。除抗真菌作用外,在多个体内外研究中发现伊曲康唑有抗肿瘤及抗内皮细胞增殖作用且优于其他唑类药物。本课题组进行前瞻性临床观察,发现口服伊曲康唑对IHs有治疗作用,但在伊曲康唑对血管瘤的作用及分子机制尚不明确。


四川大学华西医院皮肤科冉玉平教授团队在体外成功培养(图1a)和鉴定(图1b,1c)原代IHs内皮细胞(HemECs),发现伊曲康唑不仅能抑制血管瘤内皮细胞HemECs(图1d)和EOMA(图1e)增殖,还能诱导其凋亡(图2)。


图1 伊曲康唑对HemEC和EOMA细胞活性的影响


图2 伊曲康唑可促进EOMA和HemEC细胞凋亡


另外,在体外伊曲康唑还能抑制HemECs血管生成,其效果与目前IHs临床口服一线用药普萘洛尔相当(图3)。进一步确认伊曲康唑有抗血管瘤生成作用。


图3 伊曲康唑抑制HemEC的血管生成


为了研究伊曲康唑诱导血管瘤消退的作用机制,在体外HemECs经10 μM伊曲康唑处理48 h后进行mRNA基因芯片检测。通过散点图和聚类分析,以识别差异表达的mRNA(图4a,4b)。经伊曲康唑治疗后,共有172个mRNAs上调,819个mRNAs下调。基因芯片结合生物信息学分析,确定了前20个显著改变的生物过程、细胞成分和分子功能(图4c~e)以及信号通路(图4f)。其中,筛选出参与调控伊曲康唑抗血管瘤增殖和血管生成的关键信号通路为细胞因子和细胞因子受体相互作用通道,而血小板衍生生长因子D(platelet-derived growth factore D,PDGF-D)表达水平降低最为明显。


图4 体外伊曲康唑作用于HemEC的mRNA表达谱芯片分析


通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)验证,发现在体外10 μM伊曲康唑处理原代IHs内皮细胞HemECs后,HemECs中PDGF-D mRNA的表达水平明显降低(图5a)。通过蛋白印迹(Western blotting)检测发现,伊曲康唑作用后HemECs中PDGF-D蛋白表达水平减少,且呈时间依赖关系(图5b)。提示PDGF-D可能是IHs中伊曲康唑的重要治疗靶点。


进一步分析PDGF/PDGF受体(PDGFR-β)信号通路的重要下游通路的活性——PI3K/Akt/mTOR通路,这是参与血管瘤生成的一个关键的信号通路。在体外用10 μM伊曲康唑分别处理血管瘤内皮细胞HemECs和EOMA,分别检测该通路中p-Akt、p-p70S6K和p4E-BP1的磷酸化水平也下降了(图5c,5d)。该结果提示,伊曲康唑可能通过降低PDGF-D水平,从而抑制PDGFR-β的活化,抑制IHs中PI3K/Akt/mToR信号传导。 


图5 体外伊曲康唑抑制HemEC的PI3K/Akt/mTOR信号通路传导


最后,为了证实伊曲康唑是否可以通过抑制PDGF-D/PDGFR-β信号通路来抑制IHs生成,我们在体外比较了伊曲康唑与CP-673451(PDGFR-β抑制剂)对HemECs的作用。结果表明伊曲康唑和CP-673451都能抑制原代血管瘤内皮细胞HemECs的细胞增殖(图6a),促进细胞凋亡(图6b),减少血管生成(图6c),且能抑制PDGFR-β磷酸化水平及其下游效应靶点,包括p-Akt-T308、p-p70S6K、p4E-BP1(图6d)。总之,该研究提示伊曲康唑通过下调PDGF-D/PDGFR-β信号来抑制IHs的生成,并随后抑制其下游PI3K/Akt/mToR信号通路(图6e)。


虽然普萘洛尔和糖皮质激素为临床口服用药的一线治疗,但并不是所有血管瘤都治疗有效,且两者均有其局限性。普萘洛尔可引起低血压、心动过缓、低血糖、支气管痉挛等不良反应。且服用普萘洛尔之前,需要检查心血管系统,婴儿服药后24 h内需监测心率和血压。而糖皮质激素的主要副作用包括满月脸、肾上腺抑制、高血压、生长迟缓、行为改变、感染风险增加和失眠等。在临床上,我们前瞻性地观察到口服伊曲康唑成功治疗IHs(图6f),为临床医生提供一种新的治疗选择。伊曲康唑潜在的副作用主要为胃肠道不耐受和肝功能异常,通常是轻微和短暂的,停药后可缓解。目前我们仅采集了42例伊曲康唑成功治疗IHs,该研究结果仍需大量多中心临床随机对照试验进一步验证。


图6 体外伊曲康唑和PDGFR-β抑制剂(CP-673451)对HemEC有抗细胞增殖及诱导凋亡的作用


专家点评


郑捷教授:冉玉平教授从在临床上口服伊曲康唑治疗1例婴儿臀部血管瘤溃疡继发白念珠菌感染的过程中发现患者在念珠菌清除、溃疡愈合的同时原有的血管瘤消退。由此引起他的思考!继之他进行了系列的病例观察,确认了伊曲康唑对婴幼儿血管瘤的确切疗效,并申请国家自然科学基金资助对伊曲康唑的治疗机理进行了深入研究。


通过对伊曲康唑处理后的血管内皮细胞的mRNA转录组分析,发现疗效与细胞因子-受体相互作用密切相关。伊曲康唑显著降低血小板衍生生长因子D(PDGF-D)水平,抑制PDGFR-β的激活,通过PDGF-D/PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制其下游效应物,如PI3K、Akt、4E-BP1 和p70S6K,这对婴幼儿血管瘤的细胞生长和生存至关重要,在国际上首次报告血PDGF-D是伊曲康唑在婴幼儿血管瘤中的靶点。为进一步转化研究奠定了理论基础。正是冉玉平教授这种对临床的专注以及严格、严密、严谨的科学作风,使得这种偶然的发现成为必然。


冉玉平教授从临床发现、原创机理探讨、到应用转化等系列研究,在欧洲皮肤病学会和美国皮肤科学会上作为最新突破(Late Breaking)报告和权威杂志上发表论著,受到国际国内同行高度关注,这是一个潜心于临床、在临床中发现问题,再进行机制研究,最终用于临床的典型。


郑捷,耶鲁大学访问学者,博士生导师,北美皮肤科医师协会荣誉会员。现任上海交通大学医学院皮肤性病学教授。1982年毕业于上海第二医学院(现为上海交通大学医学院)后在附属瑞金医院皮肤科工作至今。先后在该校师从张传鈞、陈顺乐教授,获皮肤病学硕士与内科(风湿病)学博士学位,1992~1998年兼任上海第二医科大学医学检验系临床免疫学教研室副主任,2000~2018年担任瑞金医院皮肤科主任。中华医学会皮肤性病学分会前任主任委员;《中华皮肤科杂志》、《实用皮肤病学杂志》副主编,British Journal of Dermatology编委,New England Journal of Medicine等期刊审稿人。


专家点评


马琳教授:婴幼儿血管瘤(infantile hemangiomas,IHs)是婴幼儿最常见的皮肤良性肿瘤,发病率约为5%。由于IHs的分类分型复杂,个体差异较大,其治疗对临床工作者仍是一种极大的挑战。四川大学华西医院冉玉平教授在临床工作中偶然观察到1例IHs患儿并发溃疡,同时继发真菌感染,经口服伊曲康唑抗真菌治疗时意外发现IHs出现消退趋势,首次开创了伊曲康唑治疗IHs的先河。随后,冉教授团队的前瞻性临床观察研究发现,口服伊曲康唑对IHs有良好的治疗作用,并阐明其优势所在:①该药作为广谱抗真菌药物已在全球应用超过20年,婴幼儿中应用的安全性已经得到同行认可;②皮肤科医生和儿内科医生拥有丰富的用药经验;③儿童具有良好的耐受性,副作用可控可逆;④治疗IHs疗程短、服药剂量与常规抗真菌治疗相同,便于医生处方。


以此为基础,冉教授研究团队通过药物作用体外培养原代IHs内皮细胞,证实了伊曲康唑不仅抑制血管内皮细胞增殖,还可以诱导其凋亡的发生;通过对伊曲康唑作用后差异表达基因的筛选验证,进一步揭示了其作用机制可能与药物下调PDGF-D/PI3K/AKT/mTOR信号通路活性诱导IHs消退有关,其中的PDGF-D可能为伊曲康唑治疗的核心靶点。本项研究,不仅为IHs治疗提供了新的治疗思路,具有较好的临床应用前景,而且有望成为一种安全、方便、经济的治疗血管增生性疾病的新选择。望今后其用药疗程、疗效评估、不良反应监测及停药指征等通过扩大样本量研究进一步细化和规范。


综上,本研究从临床现象入手,在国际上首次报道了伊曲康唑成功治疗IHs,同时阐述了其可能的分子机制,具有很强的创新性,是一项中国本土开创性临床转化研究。整个研究很好地诠释了临床科研的研究模式:从临床中来,经过深入基础研究后,再返回到临床中去,展现了较高的创新性和科学性。


马琳,国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科主任、主任医师、教授、博士(博士后)导师。兼任中华医学会皮肤性病学分会第十五届委员会常务委员及儿童皮肤病学组组长、中华医学会儿科学分会皮肤病与性病学组组长、中国医师协会皮肤科医师分会儿童皮肤病亚专业委员会副主任委员、北京医学会皮肤性病学分会副主任委员、北京医学会过敏变态反应学分会第三届委员会副主任委员。从事临床工作30余年,曾留学澳大利亚一年。主要研究方向:①特应性皮炎/湿疹的研究及长期管理;②儿童皮肤血管瘤及脉管性疾病的研究及综合治疗;③感染性皮肤病;④儿童皮肤异常的激光治疗;⑤遗传性皮肤病。以第一作者或通讯作者发表文章百余篇,其中SCI收录50余篇。主编中国第一部《儿童皮肤病彩色图谱》,中国第一部专科医师培训教材《儿童皮肤病学》。近10年来作为项目负责人,获得国自然、北自然、“扬帆计划重点专科项目”等20余项科研课题,培养硕士及博士研究生50余人。2017年获得“敬佑生命•2017荣耀医者公益评选活动”-科普影响力奖。2018年以第一完成人分别获得北京市科技奖三等奖及北京医学科技奖三等奖各一项。


作者投稿心得


当我收到皮肤科知名期刊Journal of Investigative Dermatology(JID)文章修回意见的那一刻,感觉幸福来的太突然。作为皮肤科的医生都知道该期刊是我们皮肤科业内的老牌经典期刊,含金量很高,而命中率相对较低。尤记得6年前,华西医院尚无人在该期刊发表论文。那时候我才博士一年级,当时华西医院的国际学术交流活动还没有那么频繁,我怀着无比兴奋与忐忑的心情参加JID前主编来访华西医院皮肤科的学术交流会。在该期刊发表论文对于初出茅庐的我,更是一个遥远的梦。 


为什么选择JID作为我首次尝试论文送审的期刊?首先JID是冉玉平教授和我想要翻越的一座“山峰”,心中的梦想。其次,我们投不中也并没有什么损失,好的杂志拒稿很快,JID如果拒稿,5天之内就会做出决定。这时再尝试其他期刊一点也不耽误。如果能顺利进入审稿程序,大概1个月就会有JID审稿专家的优质回复。即使被拒稿,JID审稿专家的修改意见也可以让我们的论文增色不少。


为什么这次我们能收到JID投来的橄榄枝呢?是我们幸运吗?当然。但也基于我们前期做了很多的工作,打下了坚实的基础。我想最让JID的评审专家感兴趣的是,我们进行的课题是原创性研究,而且具有临床价值。婴幼儿血管瘤发病率高,严重影响患儿美观和社交心理等,是社会关注的热点,但治疗效果并不理想。在冉玉平教授的指导下,我们团队首次发现抗真菌药物伊曲康唑治疗婴儿血管瘤临床有效。同时,我们充分利用华西医院优越的科研平台(黄灿华教授团队、陆燕蓉教授团队、公共实验技术平台吴思思老师团队)积极开展基础研究,获得国家自然科学基金资助下做机理研究,发现伊曲康唑有抗血管增殖的作用,解决了社会民生的实际问题。我们在实验技术层面并无创新,主要运用一些常规技术:原代细胞分离与鉴定、凋亡、增殖、实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹及mRNA表达谱芯片结合生物信息学分析。在正式投稿前,冉玉平教授把研究结果在欧洲皮肤性病学年会、美国皮肤病学年会和日本研究皮肤科年会上以“Late Breaking News”报告,已经引起国际皮肤科同行广泛兴趣,主持人、审稿人和编辑对我们的此新发现都非常关注,期待能看到我们的详细报道,为本文呼之欲出创造了很好氛围。         

                                  

最后,如果你想投类似JID的期刊或者更高级别的杂志,对论文质量要求是非常高的,这也是我们钦佩的地方。必须注重细节,否则就准备迎接秒拒吧。在投稿前,我们进行了充分的准备,写好初稿后,我和我的导师冉玉平教授,在语言逻辑、构图、论文格式(小到标点符号上)反复推敲,一来二去,修了四稿才投出。在修改意见中提到需要加强英文语法,我们又得到了Bin Zheng教授(任职于哈佛医学院麻省总医院皮肤生物研究中心)的帮助,亲自执笔对英文语法把关,最终才呈现出大家看到JID发表的论文。


通信作者


冉玉平,四川大学华西医院皮肤科教授、博士生导师。中国菌物学会医学真菌委员会副主任委员;中国微生物学会医学真菌委员会副主任委员;中华医学会皮肤性病学分会常委、真菌学组组长、真菌研究中心首席科学家;中国中西医结合学会皮肤性病学分会委员、真菌学组名誉组长;中国医师协会皮肤性病学分会年会委员会委员、真菌学组副组长;中国医师协会整合医学医师分会整合皮肤病学委员会第一届委员会常委;中华预防医学会皮肤病与性病预防与控制专业委员会第一届委员会委员常委;中国菌物学会理事、医学真菌专业委员会副主任委员;国家级继续教育医学项目负责人;四川省皮肤性病专委会主任委员(2006-2016);四川省学术和技术带头人;获四川省科技成果二等奖;获中华医学会皮肤性病学分会卓越贡献奖;国际新发传染病研究员(美国CDC);欧洲皮肤病学会会员;亚洲-太平洋医真菌学会(APSMM)理事;Mycopathologia编委、 British Journal of Dermatology编委、《中国真菌学杂志》副主编、《皮肤病与性病》副主编;《中华皮肤科杂志》、《临床皮肤科杂志》、《中国麻风皮肤病杂志》、《中国皮肤性病杂志》、《中国循证医学杂志》、《中国中西医结合皮肤性病杂志》编委;《常见皮肤性病诊断与治疗》主编、Evidence Based Dermatology副主编;获荷兰皇家科学和艺术学院真菌生物多样性研究中心(CBS)培训证书。

Email:ranyuping@vip.sina.com


第一作者


陈爽,四川大学华西医院皮肤性病学博士研究生,导师冉玉平教授。在冉教授首次发现抗真菌药物伊曲康唑治疗婴儿血管瘤有效、获得国家自然科学基金资助下做机理研究,发现伊曲康唑有抗血管增殖的作用,伊曲康唑通过下调血小板衍生生长因子(PDGF-D)/PI3K/Akt/mTOR途径可诱导婴幼儿血管瘤消退。其间赴美国哈佛医学院麻省总医院皮肤生物研究中心,美籍华人Bin Zheng 助理教授课题组进行博士联合培养,研究抗皮肤黑素瘤药物,发现经典降糖药物苯乙双胍可增强ERK抑制剂对NF1突变型黑色素瘤的治疗作用。作为第一作者共完成6篇SCI论文,其中2篇发表在Journal of Investigative Dermatology。现在重庆医科大学附属第一医院皮肤科工作,主治医师,主要从事老药新用的临床转化医学。


共同第一作者


庄凯文,医学博士,毕业于四川大学华西临床医学院,导师冉玉平教授。在冉教授首次发现抗真菌药物伊曲康唑治疗婴儿血管瘤有效、获得国家自然科学基金资助下做机理研究,发现伊曲康唑有抗血管增殖的作用,伊曲康唑通过下调血小板衍生生长因子(PDGF-D)/PI3K/Akt/mTOR途径可诱导婴幼儿血管瘤消退。目前作为第一作者共完成8篇SCI论文,其中1篇发表在Journal of Investigative Dermatology,主持国家自然科学基金青年基金1项。现在四川大学华西医院皮肤性病科工作,主治医师,主要从事皮肤诺卡菌感染、真菌感染与原发性免疫缺陷相关研究。


团队简介


四川大学华西医院精准皮肤诊疗室


迄今,四川大学华西医院冉玉平教授团队在国内外发表皮肤镜相关临床研究论文10余篇,并在国际和国内学术会议上有着广泛交流。


扩展阅读1:Successful treatment of oral itraconazole for infantile hemangiomas: A case series.

扩展阅读2:【专业资讯】口服伊曲康唑成功治疗婴儿血管瘤:病例系列报道

扩展阅读3:Efficacy and safety of itraconazole use in infants. 

扩展阅读4:Itraconazole oral solution cured a case of infantile hemangioma on scrotum and penis with ulcer: monitoring by dermoscopy. 

扩展阅读5:伊曲康唑口服液治愈婴儿血管瘤1例: 皮肤镜监测血管瘤消退情况. 


告别2019,迎接2020,冉玉平教授团队原创贺年卡倾情奉献:两个“0”的中间是我们团队原创的“念珠菌”鼠,分别将克柔念珠菌(粉色)、白念珠菌(绿色)、光滑念珠菌(紫色)、季也蒙念珠菌(淡紫色)、近平滑念珠菌(淡黄色)接种在科玛嘉显色培养基30℃、5天后长出的各色菌落。左边鼠小伙穿着粉色实验服、右边鼠姑娘围着绿色丝巾、都双手拿着烧瓶,脑子想做研究方案,寓意我们团队博士硕士们在鼠年要更加努力、不断探索、攀登科学高峰~


Prof. Ran Yuping's Team original New Year's Card: 2 rats inside "0" indicate Candida krusei, C. albicans, C.glabrata, C.guilliermondii & C.parapsilosis growth in CHROMgar 30℃ 5 days show different color of colonies. The rats are handing the triangle bottle in the experiment, thinking about how to complete the research project, climb the next peak of science…


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本文编辑:董 敏

本文排版:陈红梅 张洪雪

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